深圳迪谱科技有限公司

两系杂交水稻是全球作物的重要组成部分，但其生育转换机制尚不清楚。利用iTRAQ定量蛋白组和转录组对两系杂交稻WuxiangS探讨其育性转化的分子机制和蛋白调控。取蛋白组和转录表达趋势一致的基因进行功能分析，这些基因与花药发育过程中能量代谢相关蛋白相关，并伴随胁迫响应通路的激活和细胞壁的修饰，最终影响了WuxiangS水稻的育性转化。

参考文献

Comparative Analysis of Proteomics and Transcriptomics during Fertility Transition in a Two-Line Hybrid Rice Line Wuxiang S

【迪谱案例：病理研究】通过iTRAQ定量蛋白组研究小鼠肠炎的发病及治疗的分子机制

小檗碱是治疗溃疡性结肠炎的有效药物。利用iTRAQ定量蛋白组对正常、肠炎和小檗碱治疗三组小鼠肠道组织进行研究，发现有140个和391个蛋白在肠炎和小檗碱处理的小鼠结肠中有差异表达。其中有26种差异蛋白包括Hist2h2be、Tubb3和5种免疫球蛋白，在肠炎和小檗碱处理的相反调控。此外，鉴定出5种常见的失调通路，包括自然杀伤细胞介导的细胞毒性和rar信号通路。这些蛋白、通路和网络为研究结肠炎的发病机制和小檗碱的作用机制提供了新的见解。

参考文献

iTRAQ-based pharmacoproteomics reveals potential targets of berberine, a promising therapy for ulcerative colitis

iTRAQ实验中，不同的组织样品分别经过蛋白质提取获得全蛋白，蛋白在胰酶作用下被酶解成肽段。

iTRAQ试剂主要由3部分组成：报告基团、平衡基团、和肽反应基团。以8标试剂为例：报告基团相对分子质量分别为113、114、115、116、117、118、119和121。每个样品的肽段选择一种iTRAQ试剂进行标记。

标记好的肽段进行等量混合。肽段经过二维液相分离后进入串联质谱。质谱利用二级图谱进行肽段鉴定，利用报告离子（113、114、115、116、117、118、119和121）的强度进行样品间蛋白相对定量。

iTRAQ定量蛋白组分析主要基于两个高效的蛋白开源软件进行：鉴定软件IPeak和定量软件IQuant。蛋白鉴定、定量过程中，利用DeepQC进行整个蛋白组检测的系统质控评估。鉴定、定量得到的蛋白，本分析会利用迪谱生物自主的功能数据库DeepFunction进行深度功能分析。

IPeak综合鉴定软件

IPeak是一款开源综合鉴定软件，具有优越的鉴定性能：

1）综合三种或以上搜索引擎（MS-GF+、X!Tandem、MyriMatch等），提升图谱利用效率

2）集合机器学习方法的后处理percolator，进一步提升图谱利用率

3）利用严格的蛋白鉴定过滤条件，包括图谱FDR和蛋白FDR，提高鉴定可靠性

4）流程接轨国际HUPO PSI（Proteomics Standards Initiative）标准蛋白组格式

IQuant蛋白定量软件

IQuant是一款开源的标记蛋白组定量软件，目前支持：iTRAQ 4-Plex、iTRAQ 8-Plex、TMT 6-Plex、TMT 10-Plex，具有由于的定量性能：

1）进行标记试剂纯度校正

2）进行缺失值有效补齐

3）进行VSN定量归一化

4）对比值进行有效的统计分析（Permutation Test以及FDR校正）

DeepQC质控控制

DeepQC主要对蛋白组数据进行鉴定与定量质控：

蛋白鉴定部分

1）蛋白提取质控

2）蛋白酶解质控

3）肽段标记质控

4）肽段分离质控

5）质谱检测质控

6）蛋白组鉴定整体质控

蛋白定量部分

1）蛋白差异倍数评估

2）蛋白定量聚类评估

3）蛋白定量重复性质控

DeepFunction蛋白功能分析

DeepFunction主要对全部蛋白、差异蛋白两个层面进行深度功能分析：

全部蛋白

1）GO分析

2）Pathway分析

3）COG/KOG/EggNOG同源蛋白簇

4）亚细胞定位

5）转录因子分析

6）激酶分析

7）染色体定位（模式生物）

差异蛋白

1）GO富集分析

2）Pathway富集分析

3）COG/KOG/EggNOG差异蛋白统计

4）差异蛋白亚细胞定位统计

5）差异蛋白转录因子统计

6）差异蛋白激酶统计

7）差异蛋白互作网络分析

研究目的

本产品针对少量样品（小于等于8个样品），进行样品间蛋白组相对定量分析。

生物重复

生物重复是科学研究严谨性的重要保证。在蛋白组学实验中，生物重复是必须的。由于iTRAQ一次实验最多能进行8个样品，而不同的研究背景对样品、表型、生物重复都有不同的需求，因此，在iTRAQ实验上需要合理设计。下述三个方案进攻参考：

样品量

iTRAQ定量蛋白组每次实验对每个样品一般需要100ug。充足的样品量可以预防实验失败，降低实验风险。下表为推荐样品量：

验证实验

一般高通量组学实验发现的差异蛋白需要进行验证实验，如转录组学后用qPCR技术进行验证。iTRAQ定量蛋白组学实验发现感兴趣的蛋白可以用靶向蛋白定量技术进行验证，如MRM、Westernblot等

蛋白序列数据库

蛋白序列数据库是目前蛋白组鉴定的基本，最终鉴定到的蛋白质序列都来源于被选择的数据库。

小迪推荐研究者目前蛋白组使用频率最高的三大类蛋白序列数据库：

1）UniProt蛋白数据库

UniProt是信息最丰富、资源最广的蛋白质数据库。它由整合Swiss-Prot、 TrEMBL 和 PIR-PSD 三大数据库的数据而成。它是经过专家校验的数据集，主要由两部分组成：UniProtKB/Swiss-Prot (包含检查过的、手工注释的条目) 和 UniProtKB/TrEMBL (包含未校验的、自动注释的条目)。一般情况下推荐优先使用UniProtKB/Swiss-Prot子集进行相应物种的蛋白质鉴定。当需要寻找新特征序列（如可变剪切，新转录本）或近源物种的鉴定时，才考虑加入UniProtKB/TrEMBL数据库。

2）基于基因组注释的蛋白数据库

主要包括NCBI和Ensembl两大基因注释系统衍生出的一系列数据库。

其中NCBI系统的主要选择参考序列（RefSeq）计划中的蛋白数据库,这是一个非冗余的蛋白质组数据库，由于NCBI注释系统的影响力，该类库广泛应用于多组学关联的分析当中。NCBI的参考序列计划（RefSeq）将为中心法则中自然存在的分子，从染色体到mRNA到蛋白提供参考序列标准。RefSeq标准为人类基因组的功能注解提供一个基础。它们为突变分析，基因表达研究，和多态发现提供一个稳定的参考点。

除此以外，NCBI还提供了非冗余蛋白质序列nr全库(non-redundant)，包括动物、植物、微生物、细菌等分类。由于该数据库来源广泛（包含GeneBank，RefSeq，SwissProt，PDB等等），因此除非是基因组注释不完整的物种，抑或需要进行同源物种的搜索。否则不推荐直接利用该库进行蛋白鉴定。

Ensembl旨在开发一种能够对真核生物基因组进行自动注释(automatic annotation)并加以维护的软件。 Ensembl具有比较完整一致的基因组、转录组、蛋白质组注释信息。非常适合用于涉及多组学关联的分析。

3) 其它来源数据库

通常指客户提供的目标蛋白数据库，或者指基因组转组学测序产生并denovo组装完成的新基因序列。另外还可以包含一些新特征的序列，如可变剪切，突变位点，融合基因等等。

提问：物种没有基因组数据库，怎么办？

解答：如果该物种没有基因组，一方面可以测该样品的转录组，通过生物信息翻译蛋白参考序列。另外，可以寻找进化关系旁系的有基因组的物种，借助他们的基因组构建蛋白参考序列。前者方法比后者更为准确。