简单样品蛋白鉴定
产品概述
基于高分辨率质谱仪的检测技术已经广泛应用到蛋白质、修饰蛋白、多肽、代谢物的鉴定上。对比传统蛋白检测方法，该技术具有以下特点：
无需依赖抗体
无需蛋白纯化
蛋白检测通量高
蛋白检测动态范围广
蛋白鉴定技术广泛的应用到动植物分子研究中，如：
特殊组织蛋白鉴定
CoIP蛋白复合物鉴定
抗体测序
未知修饰蛋白检测
【迪谱案例】通过高分辨率质谱仪进行花生双向凝胶电泳的胶点蛋白鉴定
花生种过敏原蛋白会影响其食用以及食品加工过程。本研究利用利用双向凝胶电泳分离花生蛋白，结合高分辨率质谱进行胶点鉴定。总共鉴定到264个差异花生蛋白。其中过敏原蛋白在种子发育后期逐渐升高。
参考文献
A proteomic analysis of peanut seed at different stages of underground development to understand the changes of seed proteins
基于质谱检测技术的蛋白鉴定主要是利用了shot-gun（鸟枪法）蛋白组学策略。
1）在实验方面，将样品的全蛋白提取出来，进行酶解、LC-MS/MS检测得到质谱图谱。
2）在信息分析方面，将已知物种的蛋白数据库进行理论酶解，通过理论碎裂得到理论图谱。
3）质谱图谱与理论图谱进行匹配打分，最终获得高可信度的蛋白。
研究目的
本产品针对研究样品的蛋白成分相对简单，如CoIP产物、外泌体、纯蛋白检测等。
样品量
蛋白组鉴定技术对样品量要求需要根据蛋白组检测深度而定。
对于深度蛋白组测序，小迪推荐蛋白分成20个组分进行LC-MS/MS检测，此时，样品量可参考下表；
对于微量蛋白或者不知道蛋白量的样品，如CoIP下来的蛋白液，小迪推荐样品越多越好。
生物、技术重复
生物重复是科学研究严谨性的重要保证。在蛋白组学实验中，生物重复是必须的。
由于蛋白组鉴定技术是基于信息依赖性采集（Data Dependent Acquisition DDA），这种模式对级低丰度蛋白具有随机性，多次上机重复能够增加鉴定效果。该技术推荐2次上机重复。
蛋白序列数据库
蛋白序列数据库是目前蛋白组鉴定的基本，最终鉴定到的蛋白质序列都来源于被选择的数据库。
小迪推荐研究者目前蛋白组使用频率最高的三大类蛋白序列数据库：
1）UniProt蛋白数据库
UniProt是信息最丰富、资源最广的蛋白质数据库。它由整合Swiss-Prot、 TrEMBL 和 PIR-PSD 三大数据库的数据而成。它是经过专家校验的数据集，主要由两部分组成：UniProtKB/Swiss-Prot (包含检查过的、手工注释的条目) 和 UniProtKB/TrEMBL (包含未校验的、自动注释的条目)。一般情况下推荐优先使用UniProtKB/Swiss-Prot子集进行相应物种的蛋白质鉴定。当需要寻找新特征序列（如可变剪切，新转录本）或近源物种的鉴定时，才考虑加入UniProtKB/TrEMBL数据库。
2）基于基因组注释的蛋白数据库
主要包括NCBI和Ensembl两大基因注释系统衍生出的一系列数据库。
其中NCBI系统的主要选择参考序列（RefSeq）计划中的蛋白数据库,这是一个非冗余的蛋白质组数据库，由于NCBI注释系统的影响力，该类库广泛应用于多组学关联的分析当中。NCBI的参考序列计划（RefSeq）将为中心法则中自然存在的分子，从染色体到mRNA到蛋白提供参考序列标准。RefSeq标准为人类基因组的功能注解提供一个基础。它们为突变分析，基因表达研究，和多态发现提供一个稳定的参考点。
除此以外，NCBI还提供了非冗余蛋白质序列nr全库(non-redundant)，包括动物、植物、微生物、细菌等分类。由于该数据库来源广泛（包含GeneBank，RefSeq，SwissProt，PDB等等），因此除非是基因组注释不完整的物种，抑或需要进行同源物种的搜索。否则不推荐直接利用该库进行蛋白鉴定。
Ensembl旨在开发一种能够对真核生物基因组进行自动注释(automatic annotation)并加以维护的软件。 Ensembl具有比较完整一致的基因组、转录组、蛋白质组注释信息。非常适合用于涉及多组学关联的分析。
3) 其它来源数据库
通常指客户提供的目标蛋白数据库，或者指基因组转组学测序产生并denovo组装完成的新基因序列。另外还可以包含一些新特征的序列，如可变剪切，突变位点，融合基因等等。
蛋白组鉴定主要基于开源鉴定软件IPeak记性分析。在蛋白鉴定过程中，利用DeepQC进行整个蛋白组检测的系统质控评估。鉴定得到的蛋白，本分析会利用迪谱生物自主的功能数据库DeepFunction进行深度功能分析。
IPeak综合鉴定软件
IPeak是一款开源综合鉴定软件，具有优越的鉴定性能：
1）综合三种或以上搜索引擎（MS-GF+、X!Tandem、MyriMatch等），提升图谱利用效率
2）集合机器学习方法的后处理percolator，进一步提升图谱利用率
3）利用严格的蛋白鉴定过滤条件，包括图谱FDR和蛋白FDR，提高鉴定可靠性
4）流程接轨国际HUPO PSI（Proteomics Standards Initiative）标准蛋白组格式
DeepQC质控控制
DeepQC主要对蛋白组数据进行鉴定与定量质控：
蛋白鉴定部分
1）蛋白提取质控
2）蛋白酶解质控
3）肽段标记质控
4）肽段分离质控
5）质谱检测质控
6）蛋白组鉴定整体质控
DeepFunction蛋白功能分析
DeepFunction主要对全部蛋白、差异蛋白两个层面进行深度功能分析：
全部蛋白
1）GO分析
2）Pathway分析
3）COG/KOG/EggNOG同源蛋白簇
4）亚细胞定位
5）转录因子分析
6）激酶分析
7）染色体定位（模式生物）
8）蛋白相互作用网络分析
提问：物种没有基因组数据库，怎么办？
解答：如果该物种没有基因组，一方面可以测该样品的转录组，通过生物信息翻译蛋白参考序列。另外，可以寻找进化关系旁系的有基因组的物种，借助他们的基因组构建蛋白参考序列。前者方法比后者更为准确。
